失血性休克和复苏优先在肺和肠血管系统引起 [复制链接]

原文：DOI:10./SHK.

翻译全文：

失血性休克和复苏优先在肺和肠血管系统中

引起糖萼脱落和内皮氧化应激

介绍：失血性休克最近被证明会导致内皮细胞碳水化合物表层的脱落，称为糖萼。这种糖萼的脱落被认为是创伤患者凝血病的一种介质。临床研究表明创伤后血液中脱落的糖萼增加，动物研究检测了肺、骨骼肌和肠系膜血管中的糖萼破坏。然而，没有研究测量广泛血管床中糖萼的破坏来量化这种脱落的主要位置。

方法:在本研究中，我们使用大鼠失血性休克和复苏模型来更全面地评估糖萼在一系列器官中的破坏。通过荧光标记的小麦胚芽凝集素或syndecan-1抗体染色在快速冷冻组织中评估糖萼破坏。

结果:我们发现，我们的模型确实引起了糖萼脱落，通过血浆syndecan-1水平的增加来评估。在组织切片中，我们发现最大的糖萼破坏发生在肺和肠的血管中。在大脑、心脏和骨骼肌的血管中观察到较少程度的脱落。肝血管糖萼未受影响，肾血管，包括肾小球毛细血管，显示糖萼增加。我们还测量了这些器官内皮细胞中的活性氧(ROS)，发现ROS的最大增加发生在糖萼脱落最多的两个床，即肺和肠。我们还检测到出血复苏后肺血管中的纤维蛋白沉积。

结论:我们得出结论，肺和肠的内皮特别容易受到出血复苏的氧化应激以及由此导致的糖萼破坏的影响。因此，这两个血管床可能是创伤患者凝血病的重要驱动因素。

关键词:出血，糖萼，创伤，内皮，syndecan-1，活性氧

失血性休克是创伤的常见后果，也是这些患者发病率和死亡率的重要驱动因素。近年来，创伤内皮病(Eot)(1,2)或休克诱导内皮病(SHINE)(3)被定义为描述出血和创伤后内皮细胞损伤的几个方面。这个实体的一个方面是内皮糖萼(EGX)的脱落，这是一种覆盖内皮腔表面的蛋白聚糖和糖蛋白结构(3-10)。EGX通过与内皮表面相互作用来抗凝，并且是脉管系统渗透性屏障的重要组成部分(4,11-13)。出血后EGX的脱落现在被怀疑是创伤性凝血病(TC)的重要驱动因素(3,4,6,14)。高达20%的创伤患者可见TC，并且导致死亡率增加四倍(3,6,8)。脱落的糖萼成分溶解在整个血液中，可能抑制凝血(3,8)。其机制被认为是通过糖萼的硫酸乙酰肝素成分，它是药理学肝素的内源性对应物，抑制凝血级联(15)。此外，糖萼脱落后，暴露的内皮表面可能在微血管中引发消耗性凝血病，进一步加重TC(16)。此外，糖萼脱落被认为会增加内皮层的通透性，促进组织水肿，并可能加剧器官功能障碍和衰竭(4,7,11-13,17)。我们之前表明，培养的内皮细胞暴露于缺氧-复氧导致糖萼破坏，这是由于线粒体活性氧(ROS)的产生(5)。这与其他研究表明活性氧在糖萼脱落中的作用是一致的(18-22)。

尽管人们对EGX脱落在EoT中的重要性有了越来越多的认识，但对主要发生糖萼脱落的血管床还没有进行系统的研究。不同床位可能经历不同程度的缺氧，而且这些不同血管床的内皮细胞可能表现出表型差异，从而改变对缺氧-复氧的反应。因此，对糖萼破坏位置的了解可能有助于开发减轻这一过程的治疗方法，以及识别对这一现象的病理后果特别脆弱的器官。

在这里，我们开始调查失血性休克大鼠模型中内皮糖萼释放的主要血管床。由于我们和其他人的研究表明活性氧是内皮糖萼破坏的主要途径(5,18-22)，我们还测量了血管床的内皮活性氧，以评估糖萼脱落脆弱性的任何差异是否是由于失血性休克和复苏后不同的氧化应激状态。我们推测肠和骨骼肌中的脉管系统将显示最大的糖萼脱落，因为这些器官在失血性休克期间具有最极端的血液再分布。

动物

所有的动物护理和实验都是根据杜兰大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行的，并遵循实验动物研究所的指南。研究对象是雄性SD大鼠。

手术准备

麻醉诱导是在一个含4%异氟醚的%O2小动物麻醉箱进行；在整个手术准备和手术过程中，使用含2%异氟醚的氧气维持麻醉。使用固定在枪口上的口鼻罩对所有动物进行麻醉，并对动物进行定位以暴露前体表面。右股动脉插管连接到用于监测平均动脉压的压力传感器。额外的左股动脉插管用于抽取血液。放置右颈外静脉插管，用于向研究对象灌注复苏液。每个股骨套管都配有一个三通旋塞阀，可以方便地注入抗凝剂，以保持管路通畅。使用含U/ml肝素的PBS缓冲液保持所有的插管通畅。

失血步骤

我们使用修改的威格斯方案进行了失血性休克(25)。通过左侧股骨套管从动物身上采集0.5毫升血液的初始样品；这是一个插管，从这里可以获得所有后续的血液样本。向所有血样中加入U/mL肝素10μL以防止凝固；在手术过程中，收集后的样品储存在4℃。通过抽取左股骨套管的血液使动物出血，直到达到40±3mmHg的平均动脉压。必要时通过抽血维持失血性休克30分钟，以维持40mmHg的平均动脉压。

液体复苏步骤

我们使用乳酸林格氏溶液复苏大鼠，以避免因血浆复苏(1,7,10,26)造成的糖萼重构，掩盖最初的脱落。以约2ml/分钟经颈内静脉插管灌注乳酸林格氏液，直至达到≥60mmHg的平均动脉压；这被认为是一种复苏状态。根据需要灌注乳酸林格氏溶液，在手术过程的剩余时间内维持≥60mmHg的平均动脉压。复苏30分钟后，再采集0.5ml血样。最后，通过暴露动物的胸腔和切断横膈膜来进行安乐死。采集部分心脏、肺、肠、脑、肾、肝和腹肌。立即将组织样品包埋在最佳切割温度混合物(O.C.T.,Tissue-Tek)中，并在液氮中快速冷冻。组织在-40℃下保存，直到收集所有研究对象的样本。将假手术大鼠麻醉，如上所述放置所有三条血管线。他们被麻醉90分钟作为对照组，但是没有进行出血或复苏。采集最初的0.5毫升和最终的0.5毫升血样用于血浆测试。90分钟后，收集参与出血复苏大鼠的器官。

Syndecan-1血浆定量

收集的血样在4℃下以*g离心5分钟以收集血浆。为了定量溶解(脱落的)糖萼，我们按照制造商的说明，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA,NovusBiologicalsNBP2-)分析了血浆syndecan-1水平。

糖萼成像

然后在-20℃的低温恒温器中以10μm的切片厚度快速切削冷冻组织；将切片贴在室温载玻片上。通过浸入4℃甲醇中10分钟进行固定。我们发现这种方法(快速冷冻组织，切片后用甲醇固定)比多聚甲醛固定更好地保存了糖萼(未公布的结果)。溶解于PBS的异硫氰酸荧光素标记的小麦胚芽凝集素(FITC-WGA)与4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在室温下作用1小时进行糖萼染色。一些器官也与Alexa-FluorTMphaloidin一起孵育，以帮助识别脉管系统。切片用PBS洗涤3次，并在荧光封片胶中盖片(ElectronMicroscopySciences)。脑切片中的WGA染色差异很大，在同一只大鼠的连续切片之间不可重复。因此，我们使用抗syndecan-1抗体对脑血管糖萼进行染色，结果更加一致。如上所述收集脑切片，但在室温下用含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定10分钟。然后用PBS洗涤切片3次。切片在PBS中用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。然后将切片与兔抗syndecan-1抗体(NovusBiologicalsJM11-21，1:稀释于含1%BSA的PBS)在4℃孵育过夜。随后将切片用PBS洗涤3遍，并在室温下与抗兔AlexaFluor二抗(1:稀释于含1%BSA的PBS)及DAPI孵育1小时。然后切片用PBS洗涤3次，并用氟凝胶覆盖。组织在奥林巴斯BX51荧光显微镜上成像。糖萼强度和厚度(半最大振幅时的全宽；FWHM)使用ImageJ软件(ImageJ，RRID:SCR_)和MATLAB(RRID:SCR_)进行分析。为了量化糖萼的总损失，结合了密度和厚度的减少。糖萼的总损失计算如下/p>

总的糖萼损失=（出血复苏组糖萼荧光强度/假手术组糖萼荧光强度）*（出血复苏组糖萼厚度/假手术组糖萼厚度）

HR=接受出血复苏治疗的大鼠。假=假治疗的大鼠。糖萼的总损失在正文中说明，并显示在图4中。

二氢乙啶染色

将上述在O.C.T.中冷冻的组织切片放在-20℃的低温恒温器中进行切片，厚度为10μm，切片贴在带正电的载玻片上，载玻片上涂布经去离子水稀释为0.1%的明胶。组织切片随后包被含0.1%的明胶，孵育至干燥。然后，将组织切片浸入50ml去离子水中至少10分钟，以使组织复水，并从切片中去除多余的OCT化合物，以改善染色效果。将25μL10mMDHE在二甲基亚砜中稀释于50ml去离子水中，制成5μMDHE染色液。组织切片在50ml的DHE染色液中室温和最小光照下孵育20min。然后用50ml去离子水冲洗切片3次。然后用FluoroGel覆盖切片，并立即使用奥林巴斯BX51荧光显微镜(激发波长-nm，发射波长-nm)成像，并使用ImageJ进行分析。

纤维蛋白染色

将上述在O.C.T.中冷冻的组织切片放在-20℃的低温恒温器中进行切片，厚度为10μm，切片贴在带正电的载玻片上。随后以含4％多聚甲醛的PBS固定组织切片10分钟。然后用PBS洗涤。在室温下使用含0.01％Triton-X和1%BSA的PBS封闭1小时。然后将切片与抗纤维蛋白一抗（MilliporeSigmaClone59D8MABSG，1:在含1％BSA的PBS中稀释）过夜，在4℃下过夜。然后用PBS洗涤3次。然后在室温下用FITC-WGA、DAPI和AlexaFluor抗小鼠二抗（1：）一起温育。然后用PBS洗涤3次，并使用氟凝胶盖片。组织在OlympusBX51荧光显微镜上成像。

统计分析

测量和数据以平均值±SEM表示。组间比较采用t检验。所有的t检验都是双侧的，p0.05被认为对所有的比较都有意义。

结果

血浆糖萼测定结果

为了确定我们的模型是否导致了糖萼脱落，我们收集了失血复苏或假手术前后的血浆，并定量测定了可溶性syndecan-1作为脱落的糖萼的标志物，以确定我们的模型是否导致了糖萼脱落，我们收集了失血复苏或假手术前后的血浆，并测定了可溶性syndecan-1作为脱落的糖萼的标志物。HR大鼠血浆syndecan-1浓度从16.0±2.6ng/ml增加到26.7±5.2ng/ml(n=6)，增加了67%，表明我们的模型确实诱导了糖萼脱落(图1)。假手术组Syndecan-1无明显升高(起始值12.9±2.8ng/ml，终止值15.6±2.9ng/ml，n=6)。这项分析评估了糖萼脱落到全身循环的程度，但为了确定分离器官中的局部脱落，我们接下来直接测量了我们的模型大鼠不同器官内皮上的糖萼表层。

肠血管中的糖萼

作为衡量糖萼密度的指标，在失血复苏后肠血管中的糖萼染色强度显著降低(图2A，B)。这个失血复苏组大鼠的糖萼层厚度也明显低于假手术组(1.38±0.06μm比1.18±0.06μm，图2)。根据方法一节中给出的公式，将厚度减少和强度减少相结合，总的糖萼损失为36.9%。

骨骼肌毛细血管中的糖萼

失血复苏后，骨骼肌(腹直肌)毛细血管中的糖萼染色荧光强度明显降低(图2)。糖萼厚度未受影响(假1.00±0.06μm对出血-复苏1.00±0.06μm)。计算总糖萼损失率为6.6%。

冠状血管中的糖萼

失血复苏后冠脉中的糖萼荧光强度明显降低(图2)。糖萼厚度未受影响(假手术1.29±0.09μm，出血-复苏1.37±0.09μm)。计算总糖萼损失率为4.3%。

脑血管中的糖萼

失血复苏后脑血管内的糖萼染色荧光强度明显降低(图2)。糖萼厚度无明显影响(假手术1.72±0.13μmvs出血-复苏1.84±0.23μm)。计算出这些血管的总糖萼损失是假手术血管的15.2%。

肝血管中的糖萼

失血复苏对糖萼染色荧光强度无明显影响。门静脉和肝窦均被量化(图2)。糖萼无明显增加，分别为3.6%(门静脉)和9.1%(肝窦)。

肺血管中的糖萼

出血复苏后，肺血管的糖萼染色荧光强度显著降低(图3)。糖萼厚度没有明显影响(假手术组1.96±0.31μmvs出血复苏组1.56±0.32μm)。经计算，这些血管中总糖萼损失为33.3%。我们还量化了大量肺泡组织中的WGA染色强度(图3)，发现显著降低，表明肺泡内糖萼破坏。肺泡内糖萼总损失为11.7%。

肾血管中的糖萼

与之前研究的组织相比，出血复苏后，肾大血管的糖萼染色荧光强度显著增加(图3)。在这些血管中，糖萼厚度同样增加(假手术组2.12±0.14μmvs出血复苏组2.83±0.19μm)。在这些血管中，出血复苏组的糖萼的总增加量比假手术组高52.1%。我们还量化了大量肾小球组织中的WGA染色强度(图3)。我们发现出血复苏后肾小球糖萼荧光强度显著增加，比假手术组增加了一倍多(.5%)。图4显示了所有器官计算的总糖萼损失。

内皮中的活性氧

以前的研究表明活性氧在糖萼脱落中起着不可或缺的作用(5,18-20,22,27,28)。为了探索这种关系，我们使用二氢乙锭(DHE)染色来观察内皮细胞中超氧阴离子的存在。内皮通过细胞形态和在脉管系统内的位置来识别。在分析的七个器官中，HR模型的肠、肺和肾显示内皮活性氧显著增加(图5)。相反，骨骼肌和肝脏内皮中的活性氧水平降低。

糖萼损失和活性氧之间的关系

为了可视化活性氧和糖萼脱落之间的潜在关系，我们在图6中绘制了总糖萼损失与活性氧水平的关系。由于其独特的特征，肾脉管系统被单独绘制。线性趋势(r2=0.76)表明糖萼脱落和活性氧水平呈正相关，表明糖萼破坏的差异可能是由于出血性休克时活性氧产生的差异导致。

肺血管内凝血

由于暴露了内皮表面，为了确定肺和肠血管内高水平的糖萼脱落是否导致血管内凝血，我们用抗纤维蛋白抗体对这些器官的组织切片进行了染色。我们发现肺血管在HR后显示纤维蛋白凝块沉积，而肠血管没有(图7)。

讨论

我们的研究表明，在失血性休克期间观察到的糖萼脱落并不是均匀分布在所有血管床中。以前的研究使用血浆syndecan-1作为糖萼脱落的标志，但没有研究这种脱落的位置(3，4，6，8，9，14，29)，或者单独地观察到一个或两个血管床(7，10，26，30)。我们的发现表明，肺和肠血管内皮的脱落最为明显。脑血管系统也显示出显著的糖萼破坏。为了解决导致不同血管床之间糖萼脱落异质性的潜在机制，我们还在出血复苏模型中测量了不同器官的活性氧。我们发现出现最大糖萼脱落的床也具有最大的内皮活性氧增加。这些数据，以及我们和其他人先前发表的结果(5，18-20，22，27，28)支持了我们的工作假设，即活性氧的增加是内皮糖萼破坏的起始因素。

有趣的是，尽管肾小球和大血管内皮细胞中的活性氧增加(图6)，但出血复苏后肾脉管系统显示糖萼异常增加(图4)。我们的实验持续时间很短(总共一个小时)，故对于肾脏中糖萼生成可能大规模上调存在争议。另一种解释是，其他血管床中脱落的糖萼沉积在肾脏中，特别是肾小球中。这可能会掩盖该器官中活性氧增加所产生的任何糖萼破坏，并且其水平增加高于在假手术肾中看到的。尚不清楚这种设想的糖萼沉积的潜在生理效应是什么。如果糖萼过度增加，理论上可能会降低肾小球滤过率，导致或加重严重失血性休克后常见的急性肾衰竭(31)。此外，糖萼的增加也可能导致肾小球内的炎症反应。最近的一项研究表明，狼疮性肾炎小鼠模型中肾小球糖萼增加，这导致T细胞渗入肾小球，与糖萼透明质酸成分的结合而聚集(32)。未来的工作将研究出血性休克中肾小球糖萼的积累是否导致急性肾衰竭。

研究表明，在失血性休克期间，心输出量减少(23，24)。这种降低的心输出量通过选择性血管收缩来重新分配，以维持高代谢需求器官—大脑和心脏的灌注(23，24)。肝动脉接收的心输出量百分比也增加(23，24)。然而，门静脉接收的心输出量百分比降低，因此流向肝脏的总血流量可能减少(23，24)。肾脏、骨骼肌和肠系膜接受的心输出量百分比都经历了类似的比例下降(23，24)。肺循环接收%的心输出量，因此当心输出量减少时，在出血期间血流减少。我们的结果并不表明糖萼脱落的水平完全由出血期间这些不同器官经历的血流减少来预测。肠经历了类似的骨骼肌血流量减少(23，24)，但我们的结果显示仅在肠血管出现高水平的活性氧和大量糖萼破坏。此外，肾脏与骨骼肌和肠道出现类似的血流量减少。事实上，我们确实发现肾脏内皮中的活性氧增加，但糖萼没有减少(尽管这可能是由于如上所述来自其他地方的糖萼的积累)。

肠道和骨骼肌糖萼脱落的差异似乎是由于ROS反应不同造成的。虽然据报道，两个床位在出血期间都得到了显著的血流量减少，但只有肠血管内皮细胞表现出明显的ROS增加(图6)。因此，不同床位的内皮细胞对缺血再灌注损伤的敏感性可能存在异质性。一种耐人寻味的可能性是，骨骼肌毛细血管对缺氧具有抵抗力，这是对大负荷运动期间组织中预期的氧气张力周期性降低的一种适应。这种可能性意味着来自不同血管床(33-35)的内皮细胞之间存在表型异质性。事实上，在一项使用小鼠脑、心和肺内皮细胞的研究中，已经注意到基因表达的异质性(36)。虽然这项研究没有包括骨骼肌内皮细胞，但他们的数据确实表明，肺内皮细胞表达的超氧化物歧化酶水平低于脑或心脏内皮细胞。这可能导致肺内皮细胞对失血-复苏损伤的脆弱性。未来还需要进一步研究不同层内皮细胞之间潜在的表型差异，这些差异可能导致不同的缺血再灌注反应。

除了肾血管，ROS和糖萼破坏之间关系的另一个异常值是脑血管。脑循环显示糖萼明显脱落，尽管程度不同于肺或肠血管。然而，脑血管中的ROS并没有明显增加。这很耐人寻味，因为它表明大脑糖萼可能对失血性休克敏感，但通过一条独立于ROS的途径。大脑循环在许多方面都是独一无二的(35)，因此可能对出血有明显的反应。脑内皮细胞糖萼被认为有助于血脑屏障(37)，因此这一结构的破坏可能导致创伤患者脑损伤的加重(38)。未来针对糖萼脱落的潜在治疗方法可能必须考虑到脑循环中独特的信号机制。未来的工作将对这种可能性进行调查。

在本研究中，我们使用乳酸林格氏液进行复苏。虽然不是治疗失血性休克的现代治疗标准，但我们做出这个决定是为了最大限度地减少血浆复苏引起的糖萼再生长的可能性(7，10，26)。这一现象已经在各种失血性休克模型中观察到，并可能掩盖我们开始量化的最初脱落。我们确信，在我们的模型中观察到的糖萼脱落不是由于乳酸林格氏复苏的血液稀释效应，而是由于缺血和再灌注损伤。这是因为糖萼丢失与不同血管床中的ROS水平有相当好的相关性，这表明了一种信号机制(图7)。此外，各种血管床表现出广泛的糖萼破坏。如果血液稀释是罪魁祸首，那么所有的血管床都会受到干扰。

先前关于失血性休克时糖萼脱落的研究发现，肺和肠血管系统(2，7，39-41)以及提睾肌血管系统(10，26，30)出现糖萼显著丢失。我们的结果与这些研究大体上是一致的。我们在腹直肌毛细血管中发现轻微但显著的糖萼破坏，而在提睾肌血管中有更大程度的脱落(10，26，30)。骨骼肌血管脱落程度的这种差异可能是由于休克模型和糖萼测量方法的不同所致。具体地说，先前的研究使用活体显微镜进行体内糖萼测量，而我们的研究使用组织切片。然而，由于我们在所有器官上使用了相同的组织保存和染色程序，我们的技术将允许器官之间的相对比较，应该不会影响我们的结论，即：最大的糖萼破坏发生在肺和肠道。

除了确认肺部是糖萼脱落的重要部位，因为它与凝血障碍有关，我们的结果还揭示了创伤患者中急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患病率(42)。作为内皮细胞通透性屏障的重要组成部分，现在认为肺毛细血管糖萼的破坏是导致ARDS的原因(43)。我们的结果表明，肺内皮细胞对失血性休克期间发生的氧化应激和由此产生的糖萼脱落特别敏感。未来的工作需要了解这种敏感性的机制基础，这样才能开发出预防和逆转这种破坏的治疗方法。

糖萼脱落被认为由于硫酸乙酰肝素成分在整个血液的溶解而促进休克中凝血病的发生(3，4，6，8)。然而，糖萼破坏后暴露的内皮也可能导致消耗性凝血病(16)。为了测试出现高水平糖萼脱落的器官是否显示血管内凝血，我们对组织切片进行了纤维蛋白沉积染色(图7)。我们发现，肺血管系统中高水平的糖萼破坏确实显著增加了内皮表面的纤维蛋白凝块。然而，肠血管中同样高水平的糖萼脱落并没有引起任何血管内凝血。这种有趣的对比可能是由于两个床的内皮表面在促进凝血方面的敏感性不同。另一种可能性是，不同的血液动力学环境会使肺血管更容易发生血管内凝血。肺脉管系统是比体循环低得多的压力系统。此外，总血流量在肺循环中预计会更高，而在休克期间，肠道脉管系统经历血管收缩和伴随的血流量减少。未来的工作需要区分这些可能导致血栓形成差异的原因，并研究肺血管系统是否是失血性休克和创伤中消耗性凝血病的重要部位。

本研究利用小麦胚芽凝集素(WGA)对糖萼进行染色，这是一种应用广泛的技术。WGA与糖萼的重要成分唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖残基结合(13)。脑组织切片没有很好地染色内皮糖萼，可能是由于WGA与脑实质的高水平结合所致。因此，我们在这个血管床上使用syndecan-1染色，它产生了与其他器官的WGA染色相似的形态(内皮细胞管腔表面的明亮染色)。然而，使用syndecan-1对糖萼染色的一个限制是潜在的厚度测定损失。Syndecan-1的蛋白骨架是抗体的靶标，其长度不变。糖萼厚度的变化可能是由于分子组成的碳水化合物侧链的不同长度造成的。因此，Syndecan-1染色可以显示糖萼的普遍丢失，但可能不会给出任何有关层厚度的潜在细微差异的信息。

我们发现，糖萼厚度在器官之间的变化范围较低，从0.75μm到2μm。这与体内测量结果一致，据报道为1-2μm(10，32，37，44-46)。我们没有使用电子显微镜来测量糖萼，因为大多数使用这种技术的研究产生的糖萼厚度为纳米，而不是在体内看到的微米级结构(11)。尽管电子显微镜的分辨率有望以令人印象深刻的细节揭示糖萼，但似乎很明显，需要发展与电子显微镜相匹配的组织固定技术，以更一致地保存糖萼。

总之，我们的结果表明失血性休克和复苏破坏了主要在肺和肠脉管系统中的内皮糖萼，并且这些床也显示了内皮中最大水平的活性氧。因此，糖萼保存的未来治疗选择应该集中在这些血管床上。

图1。失血性休克和随后的复苏后，血浆syndecan-1浓度升高。对大鼠进行失血性休克和复苏或假手术对照。在实验开始时(手术开始)和完成心率实验后或假手术90分钟后(手术结束)采集血浆样本。用酶联免疫吸附法测定血浆syndecan-1水平。n=每组6只大鼠。*与SHAM对照组大鼠相比，p0.05。

图2。肠、腹肌、心脏、大脑和肝组织中糖萼密度和厚度的分析。通过荧光标记的麦胚凝集素染色，在出血复苏大鼠或假对照大鼠中观察糖萼密度，并在(B)中定量。厚度定义为糖萼层半幅最大值处的全宽。染色强度以任意单位表示。箭头表示糖萼层。比例尺=10μm。n=每组4只大鼠*p0.05与SHAM模型相比。

图3。肺和肾组织中糖萼密度和厚度的分析。通过荧光标记的麦胚凝集素染色，在出血复苏大鼠或假对照大鼠中观察糖萼密度，并在(B)中定量。厚度定义为糖萼层半幅最大值处的全宽。染色强度以任意单位表示。箭头表示糖萼层。单个肺毛细血管不能在肺泡或肾小球中分辨，因此仅报道了完全糖萼染色强度。虚线描绘了单个肾小球的边界。比例尺=10μm。n=每组4只大鼠*p0.05与SHAM模型相比。

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图4。各血管床的糖萼总损失。使用方法部分中给出的公式，结合厚度变化和染色强度变化，计算总损失。白条表示HR动物中的糖萼。黑条表示SHAM水平(设置为%)。

图5。失血性休克和复苏反应中活性氧浓度变化的组织依赖性。超氧阴离子浓度通过出血复苏大鼠或假对照大鼠中的二氢乙锭染色显现，内皮细胞中的平均染色强度被量化。使用血管壁内的形态学和定位，以及小麦胚芽凝集素对骨骼肌的共染色来鉴定内皮细胞。n=每组4只大鼠，*p0.05与SHAM模型相比。

图6。糖萼降解与内皮活性氧的变化相关。每个器官的糖萼百分比变化与每个器官内皮细胞的活性氧百分比变化(双氢乙锭染色)相对应。糖萼的负百分比变化意味着糖萼的丢失。虚线是关系的趋势线。由于肾脏在我们模型中的独特特征，肾血管和肾小球被分开绘制。

图7。出血和复苏导致肺血管纤维蛋白沉积。纤维蛋白沉积物用特异性一级抗体染色(红色)，WGA和DAPI用作复染剂(分别为绿色和蓝色)。箭头指示高倍放大图像中的纤维蛋白沉积。在假手术或HR大鼠的肠血管中未观察到纤维蛋白沉积。纤维蛋白沉积覆盖的组织切片的百分比面积和肺组织每张图像的平均沉积数用条形图量化。n=每组4只大鼠，*p0.05与SHAM模型相比